三代測(cè)序的原理

一、測(cè)序原理先介紹 nanopore 測(cè)序中的幾位主角：
reader ：在自然界中，有一種可以嵌入到細(xì)胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有**的蛋白納米孔。經(jīng)過(guò)人為基因工程修飾后，得到的就是 nanopore 測(cè)序所需的 reader 蛋白。
membrane：reader 蛋白會(huì)被嵌入到高電阻率的 membrane （人工合成的多聚物膜），膜兩側(cè)是離子溶液，在兩側(cè)加不同的電位，離子就會(huì)在孔中流動(dòng)，形成電流。
motor：在 nanopore 文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，需要在接頭上連接一種動(dòng)力蛋白，用于將dna或rna分子推入納米孔中。以dna解螺旋酶作為 motor（動(dòng)力蛋白）為例，它可以除了可以解開(kāi)雙螺旋，使之變?yōu)閱捂湥€可以提供推動(dòng)力。
tether：該蛋白用于錨定dna或rna鏈，防止在溶液中飄動(dòng)，并使其進(jìn)入納米孔中。
這時(shí)，解開(kāi)的其中一條鏈會(huì)穿過(guò)蛋白質(zhì)孔，它在通過(guò)蛋白孔時(shí)，會(huì)對(duì)膜兩邊離子的穩(wěn)定流動(dòng)產(chǎn)生擾動(dòng)。不同的堿基，對(duì)離子流的影響不同，也就會(huì)產(chǎn)生不同的電流大小，進(jìn)而形成下面的電流信號(hào)圖。
利用這些電流信號(hào)，使用計(jì)算機(jī)軟件識(shí)別后，推斷出堿基類(lèi)型，完成測(cè)序。
二、測(cè)序儀介紹雖然 nanopore 測(cè)序儀種類(lèi)很多，但都是基于nanopore芯片來(lái)搭建的平臺(tái)，大到由多個(gè)芯片陣列組成的promehion，gridion系列測(cè)序儀，小到可以連接手機(jī)的type c，電腦usb的mnion系列便攜式測(cè)序儀。
這里邊，較*的就是mnion系列，2016年8月，美國(guó)宇航員凱特·魯賓斯在**空間站完成微重力條件的dna測(cè)序。
它在測(cè)序時(shí)，一般像下圖這樣連接就行，顯而易見(jiàn)的便攜性。比如，可以直接用它在深入疫區(qū)采集樣本后進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，為防疫工作爭(zhēng)取大量寶貴的時(shí)間和資源。
測(cè)序時(shí)，將制備好的文庫(kù)或樣本溶液，滴在芯片小孔中，開(kāi)始測(cè)序。
一張芯片中有 2048 個(gè) membrane wells，也就是芯片上的一個(gè)孔，每個(gè)孔包含一個(gè)nanopore reader。
每四個(gè) wells 共享一個(gè) amplifier（信號(hào)放大器），一張芯片中有 512 個(gè)信號(hào)放大器，也就是 512 組 wells。
在啟動(dòng)測(cè)序儀后，機(jī)器自檢，會(huì)將每組 wells 中依據(jù)效率高低排序。測(cè)序開(kāi)始，儀器先用每組 wells 中效率較高的 wells，運(yùn)行 8 小時(shí)后，更換效率*二的，以此類(lèi)推。
但是，在實(shí)際使用過(guò)程中，只有 1200 個(gè) wells可以正常工作。
造成 wells 失效的原因：
wells 中沒(méi)有 reader 蛋白，或納米孔不通，這時(shí)無(wú)電信號(hào)
膜破損，這時(shí)有強(qiáng)電信號(hào)，不能正常測(cè)序
在單個(gè) well 中有兩個(gè)及以上的 reader 蛋白，電信號(hào)互相干擾
三、建庫(kù)方法1、1d 文庫(kù)1d文庫(kù)是將dna雙鏈，解鏈為正義鏈與反義鏈，分別測(cè)序，大約有 85% 的堿基判讀準(zhǔn)確率。
目前1d文庫(kù)有兩種建庫(kù)方案：
標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)
將 dna 打斷
補(bǔ)齊dna末端，末端加 a 堿基
連接 adapter（ 接頭序列），接頭上連有 motor 蛋白
接頭中有一段序列可以與 tether 蛋白結(jié)合，作用是為了將 dna 鏈吸附在膜上，將 dna 錨定，不易被溶液洗走
下圖是 tether 與接頭序列識(shí)別及錨定過(guò)程
轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)
建庫(kù)時(shí)使用連有測(cè)序接頭的轉(zhuǎn)座酶，該酶可以將長(zhǎng)鏈 dna 鏈切斷
由于該酶的特性，會(huì)在dna的斷點(diǎn)兩端加接頭序列
隨后在測(cè)序接頭加入 motor 蛋白
2、 文庫(kù)在 dna 兩側(cè)接 接頭，其他步驟和 1d 文庫(kù)類(lèi)似。
這種文庫(kù)中的 接頭，可以讓*二鏈緊跟**鏈來(lái)一起測(cè)序。
由于可以測(cè)到兩條鏈，可以相互矯正，進(jìn)而提高判讀準(zhǔn)確率，能達(dá)到 90%以上的堿基判讀準(zhǔn)確率。
但是，由于文庫(kù)質(zhì)量，蛋白活性等因素，導(dǎo)致并不是所有的**鏈后都會(huì)測(cè)到*二鏈。
四、堿基判讀在測(cè)序過(guò)程中，得到的信號(hào)并不是每次測(cè)得一個(gè)堿基信號(hào)。而是根據(jù) reader 蛋白孔的縱向長(zhǎng)度，r9 大約為 5 個(gè)堿基長(zhǎng)，也就是說(shuō)，同時(shí)會(huì)測(cè)得 5 個(gè)堿基的電信號(hào)，這并不是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的判斷過(guò)程。
目前，nanopore 公司采用一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法，遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（rnn），對(duì)堿基進(jìn)行判讀。
該過(guò)程簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，是將已知堿基序列的電信號(hào)波形圖做訓(xùn)練集和測(cè)試集，通過(guò)修正參數(shù)，拿到模型。最后，將新測(cè)到的未知序列的波形圖與之比對(duì)，從而提高判讀準(zhǔn)確率。
但是，還是有誤讀情況：
由于空間結(jié)構(gòu)相似性，嘌呤間誤讀，嘧啶間誤讀較容易發(fā)生。
堿基復(fù)雜度低的序列（如，polya序列），較容易誤讀
五、測(cè)序影響因素電壓以r9芯片為例，測(cè)序過(guò)程，先用 180 mv 電壓，每 10 min，短時(shí)間翻轉(zhuǎn)電壓方向，作用是激活被堵住或卡住的 reader 蛋白孔。但是，這個(gè)過(guò)程也會(huì)使正常測(cè)序的 dan鏈倒吐回去。
隨著電極使用時(shí)間的增加，電極的電壓會(huì)發(fā)生漂移，因此每過(guò)兩小時(shí)，要增加 5mv 電壓抵消影響。
速度與產(chǎn)量r9 芯片，測(cè)序速度是 250 堿基/s，一張芯片可以得到約 5 ~ 10 g的堿基序列。
北京立博泰業(yè)科技有限公司專(zhuān)注于離心機(jī),三代測(cè)序,純水儀,正倒置一體研究級(jí)顯微鏡等